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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)條件溫度和時(shí)間設(shè)置
點(diǎn)擊次數(shù):369 更新時(shí)間:2025-04-01

        聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)原理是生物學(xué)的聚合酶鏈反應(yīng)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈,低溫(經(jīng)常是60°C左右)時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合,再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。

        PCR反應(yīng)條件的選擇技巧主要體現(xiàn)在溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)上,溫度過(guò)高,延伸時(shí)間不夠都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響,以下總結(jié)方法技巧。

  溫度與時(shí)間的設(shè)置: 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40 ~60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100~300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

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  1、變性溫度與時(shí)間
 
  變性溫度低,解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間,但溫度不能過(guò)高,因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性,就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。
 
  2、延伸溫度與時(shí)間
 
  Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性:
 
  70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子
 
  70℃ 60核苷酸/S/酶分子
 
  55℃ 24核苷酸/S/酶分子
 
  高于90℃時(shí), DNA合成幾乎不能進(jìn)行。
 
  PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為72℃,過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時(shí)間1min是足夠的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。
 
  3、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間
 
  退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度:
 
  Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
 
  復(fù)性溫度=Tm值-(5~10℃)
 
  在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間*結(jié)合。
 


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